Development of a PCR-based Assay for the Detection of Plasmodiophora brassicae in Soil

Abstract

A single-tube nested polymerase chain reaction (STN PCR) method was developed for detecting the causal agent of clubroot disease, Plasmodiophora brassicae. Outer primer PBTZS-2 (5′-CCGAATTCGCGTCAGCGTGA-3′) to amplify a 1457 bp-fragment from P. brassicae DNA and nested primers, PBTZS-3 (5′-CCACGTCGATCACGTTGCAAT-3′) and PBTZS-4 (5′-GCTGGCGTTGATGTACTGGAA-TT-3′), to amplify a 398 bp-fragment internal of the 1457 bp-fragment were used for the STN PCR. The 398 bp-fragment was amplified from as little as 1 fg of P. brassicae DNA with the STN PCR. A protocol for extracting P. brassicae DNA directly from soil was developed. By using the protocol, DNA was extracted from artificially infested soil containing various numbers of P. brassicae resting spores and the resulting DNA was used as template for the STN PCR. As little as one resting spore of P. brassicae per g of soil was detectable with the STN PCR. The STN PCR was applied to naturally infested soil from 3 fields and one canal bed. The 398 bp-fragment was amplified from soil of 2 fields and the canal bed. To improve the detection of P. brassicae, the STN PCR products were subjected to second PCR amplification (double PCR) using the nested primers PBTZS-3 and PBTZS-4. The double PCR amplification generated a single 398 bp-DNA band which was visualized clearly on the agarose gel for all the 4 soil samples tested. A combination of the STN PCR and the double PCR appears a useful assay method for detecting P. brassicae resting spores in field soil. Zusammenfassung Entwicklung eines PCR-Tests zur Detektion von Plasmodiophora brassicae im Boden Um den Erreger der Kohlhernie, Plasmodiophora brassicae, zu detektieren, wurde eine Single-tube nested polymerase chain reaction (STN PCR) entwickelt. Dabei wurde der ausere Primer PBTZS-2 (5′-CCGAATTCGCGTCAGCGTGA-3′) zur Amplifizierung eines 1457 bp-Fragments von P. brassicae-DNA verwendet, die genesteten Primer PBTZS-3 (5′-CCACGTCGATCACGTTGCAAT-3′) und PBTZS-4 (5′-GCTGGCGTTGATGTACTGGAATT-3′) dienten der Amplifizierung eines 398-bp-Fragments innerhalb des 1457-bp-Fragments. Das 398-bp-Fragment wurde mit der STN PCR aus nur 1 fg P. brassicae-DNA amplifiziert. Ein Protokoll zur Extraktion von P. brassicae-DNA direkt aus dem Boden wurde entwickelt. Bei seiner Anwendung wurde DNA aus kunstlich infiziertem Boden isoliert, der unterschiedliche Mengen an P. brassicae-Dauersporen enthielt. Die erhaltene DNA diente als Matrize fur die STN PCR. Mit der STN PCR war selbst eine einzige Dauerspore von P. brassicae pro g Boden nachweisbar. Die STN PCR wurde mit naturlich infiziertem Boden aus 3 Feldern und einem Kanalbett durchgefuhrt. Das 398-bp-Fragment wurde aus Boden von 2 Feldern und dem Kanalbett amplifiziert. Um die Detektion von P. brassicae zu verbessern, wurden die Produkte der STN PCR einer zweiten PCR-Amplifizierung unterzogen (doppelte PCR), wobei die genesteten Primer PBTZS-3 und PBTZS-4 verwendet wurden. Die doppelte PCR-Amplifizierung erzeugte eine einzige 398-bp-DNA-Bande, die bei allen 4 getesteten Bodenproben auf dem Agarosegel deutlich zu erkennen war. Eine Kombination von STN PCR und doppelter PCR scheint ein nutzliches Verfahren zur Detektion von P. brassicae-Dauersporen in Feldboden zu sein.