A method for recovery of <i>Candida albicans</i> DNA from larger blood samples and its detection by polymerase chain reaction on proteinase genes

Abstract

Summary. A method for the detection of Candida albicans from up to 15 ml of blood by polymerase chain reaction (PCR), based on the differential resistance of mammalian and fungal cells towards detergent was developed. The procedure essentially involved removal of the blood cells by sodium dodecyl sulfate (SDS) induced lysis, followed by DNA extraction after degradation of fungal cell walls by a recombinant β‐1,3‐glucanase. The genes of two different aspartic proteinases from C. albicans , SAP1 and SAP2, with an overall homology of 77% in their nucleotide sequences, were chosen as targets for PCR. The oligonucleotide primers used were directed to strictly conserved regions similar in both genes. As the number of base pairs between the primers are different in the two genes, amplification products of 220 bp and 238 bp in length were obtained. This led to a characteristic double band in subsequent agarose gel electrophoresis. The detection limit for a nested PCR was less than 10 C. albicans cells ml ‐1 of seeded blood. The detection limit of conventional PCR from a blood volume in the 10 ml range was less than 100 yeasts ml ‐1 . Preliminary trials with clinical blood specimens suggested, that conventional PCR from large blood samples, being less laborious and prone to contamination than nested PCR, could be suited for the detection of deepseated C. albicans mycosis. Zusammenfassung. Basierend auf der unterschiedlichen Resistenz von Säuger‐ und Pilzzellen gegenüber Detergenzien wurde eine Methode zum Nachweis von Candida albicans mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) aus bis zu 15 ml Blut entwickelt. Hierbei wurden im wesentlichen die Blutzellen zuerst mit Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert und entfernt, wobei die DNA‐Extraktion aus den Pilzzellen erst nach Abbau der Zellwand durch eine rekombinante β‐1,3‐Glucanase erfolgte. Als Zielgene für die PCR wurden zwei unterschiedliche Aspartatproteasegene von C. albicans , SAP1 and SAP2 ausgewählt, welche eine Homologie von 77% in ihrer Nukleotidsequenz aufweisen. Die verwendeten Oligonukleotid‐Primer waren dabei auf streng konservierte Regionen, welche in beiden Genen identisch sind, gerichtet. Da die Anzahl der Basenpaare zwischen den Primern in beiden Genen unterschiedlich ist, wurden unterschiedlich lange Produkte von 220 und 238 Basenpaaren amplifiziert, welche in der anschlieβenden Agarose‐Gelelektrophorese als charakteristische Doppelbande imponierten. Die Nachweisgrenze einer Nested‐PCR bei Verwendung von in vitro infiziertem Blut lag unter 10 C. albicans ‐Zellen pro Milliliter. Wurde eine konventionelle PCR aus 10 ml Blut durchgeführt, Lieben sich weniger als 100 Hefern pro Milliliter nachweisen. Erste Untersuchungen mit klinischen Proben zeigten, daB besonders die konventionelle PCR aus groben Blutvolumina, welche weniger aufwendig und anfallig fuUr Kontaminationen als eine Nested‐PCR ist, fuUr den Nachweis einer tiefen C. albicans‐Mykose geeignet sein koUnnte.